故事发生在抗日战争时期。军统谍报网接二连三遭到日本驻华特务头目中村一郎（于震 饰）的疯狂破坏。为报复日特、以血还血，军统局局长戴笠（王岗 饰）从息烽集中营挑选出因在淞沪战役时阻挠军统抓捕中共地下党员而被捕入狱的原国民革命军陈一鸣（庹宗华 饰）少校，令他组建一支代号“眼镜蛇”的突击队，暗杀中村一郎。领命后，陈一鸣即刻招募各路高人进行严酷培训。恰在此时，中村逮捕了美国海军情报署的特工史密斯夫妇。美军上校梅乐斯找到戴笠，请求设法营救。中共高级特工黄天明（侯勇 饰）收到了南京联络站站长黄云晴（吴晓敏 饰）送来的情报——她通过潜伏在日军里的内线搞到了史密斯所在医院的地图和戒严情况。黄天明奉上级指示，将这份关键情报故意泄露给军统南京站高站长。陈一鸣带着特工小组出发了，队员们空降渗透到南京，隐藏在萨尔神父的意大利教堂内。日军很快发现了端倪，中村一边命令全城戒严，一边准备以史密斯为诱饵，等待突击队自投罗网。小组成员们化装成日本劳军演出队混入医院，成功劫走史密斯夫妇并把医院炸成火海。正当队员们准备返程之际，陈一鸣却表示，这次行动还有一项首要任务——刺杀中村一郎。为了完成任务，书生负责做中村昔日恋人、歌女蝴蝶的思想工作，试图让她引诱中村暴露在狙击手冷锋的枪口下。然而，蝴蝶在狙击现场却放走了中村，小组成员只得迅速转移，萨尔神父和孩子们因此被捕。面对绝境，陈一鸣等人决定制造众人被炸死的假象，让蝴蝶再次去接近中村，一场惊心动魄的连环暗杀与生死博弈就此展开……他们最终能顺利完成任务吗？